實驗：如何進行蛋白質含量分析
这篇文章给大家聊聊关于實驗：如何進行蛋白質含量分析，以及对应的知识点，希望对各位有所帮助，不要忘了收藏本站哦。
在蛋白质纯化分离过程中，常常需要反复测定溶液中的蛋白质含量。以下是快速分析蛋白质的四种方法。这四种方法各有优缺点，测得的蛋白质浓度也不同。因此，实验者必须选择适合自己系统的方法。
双缩脲蛋白质分析法蛋白质或多肽与溶液中的碱性铜离子反应时，由于氮原子与铜离子之间的配位键而形成紫色离子。该紫色离子的浓度与溶液中的蛋白质浓度成正比。双缩脲蛋白质分析方法就是基于这个原理。用已知浓度的标准蛋白溶液（通常是牛血清白蛋白）与双缩脲试剂反应，然后在540 nm处测量溶液的吸光度，建立蛋白浓度和吸光度的校准曲线。通过测量未知样品在相同波长下的吸光度，并与校准曲线匹配，即可得出样品中的蛋白质浓度。
双缩脲蛋白质测定是一种快速且简单的测定。除氨基酸缓冲液、Good’s缓冲液、Tris缓冲液引起显色异常外，干扰分析结果的因素很少。双缩脲分析的缺点是灵敏度差。
Lowry蛋白分析法Lowry蛋白分析法是目前广泛应用的高灵敏度分析方法。利用Lowry反应分析蛋白质是缩二脲蛋白质分析方法的延伸。第一步也是在碱性溶液中形成铜-蛋白质化合物。之后，由于第二试剂Folin-Ciocalteu试剂的加入，蛋白质化合物的酪氨酸和色氨酸会溶解含有磷钼酸和磷钨酸盐的Folin-Ciocalteu。试剂还原成深蓝色，颜色更明显。 Lowry分析法比缩二脲法更灵敏，但需要更多时间。一般来说，Lowry分析法每毫升可检测20200g蛋白质，灵敏度约为缩二脲法的100倍。
这种方法的缺点是干扰因素较多，时间控制必须比较准确。应避免使用Good 缓冲溶液，因为在此方法中它们的背景吸光度极高。此外，如果溶液中含有其他干扰物质，如硫酸铵（0.15%）、甘氨酸（0.5%）和硫醇，也应避免使用此方法。由于不同的蛋白质含有不同量的酪氨酸和色氨酸，Lowry分析方法不太适合分析绝对蛋白质含量，但相当适合测量同一蛋白质的浓度变化。
Lowry分析方法与双缩脲法相同。需要使用已知浓度的标准蛋白（牛血清白蛋白）溶液与试剂反应，然后在540 nm处测量溶液的吸光度，建立蛋白浓度和吸光度的校准曲线。通过测量未知样品在相同波长下的吸光度，并与校准曲线匹配，即可得出样品中的蛋白质浓度。
(3)Bradford蛋白质分析方法
Bradford 蛋白质测定是一种利用蛋白质与染料结合的测定。该方法可以克服缩二脲法和Lowry法所面临的一些限制。布拉德福德法的原理是使用考马斯亮蓝染料在酸性溶液中与蛋白质结合。其最大吸收波长将从465 nm移至595 nm，吸光度与蛋白质浓度成正比，从而测定蛋白质含量。由于显色仅需2分钟，并且颜色保持稳定约1小时，因此该方法非常容易操作。 Bradford法的灵敏度与Lowry法相当，甚至超过Lowry法，可测定约1140g蛋白质。与Lowry法一样，不同的蛋白质会影响吸光度。 Bradford法中干扰物质不多。目前已知一些表面活性剂，如Triton X-100和十二烷基硫酸钠(SDS)，会导致实验出现误差。
实际操作中，Bradford分析方法与前面的方法相同。需要使用已知浓度的标准蛋白溶液（牛丙种球蛋白或牛血清白蛋白）与试剂反应，然后在540 nm处测量溶液的吸光度，以建立蛋白浓度与吸光度之间的关系。校准曲线。通过测量未知样品在相同波长下的吸光度，并与校准曲线匹配，即可得出样品中的蛋白质浓度。
分光光度计分析方法由于大多数蛋白质含有酪氨酸和色氨酸，因此在波长280 nm处有最大吸收峰。在生产蛋白质的环境中，常常存在其他在280 nm 波长处吸收的杂质。例如，核酸在260 nm处有最大吸收峰，因此它们总是在280 nm处有吸收值。即便如此，通过测量样品在280 nm和260 nm处的吸光值并用下式计算，可以消除核酸造成的干扰。
蛋白质浓度（毫克/毫升）=1.55·A280 0.76·A260
分光光度计分析方法具有快速、样品量小、灵敏度好、干扰低等优点，但其准确性较差，更适合快速估算蛋白质浓度。
药物
Lowry 蛋白质分析乳清蛋白(-Lactalbumin)，从之前的实验中纯化
碳酸氢铵水溶液，0.05 M
Folin-Ciocalteu试剂（原液浓度2N，用去离子水稀释1倍，终浓度1N）
试剂A：硫酸铜水溶液（1.56 g CuSO45H2O/100 ml）
试剂B：酒石酸钠水溶液（2.37g酒石酸钠/100ml）
试剂C：碳酸钠-氢氧化钠水溶液（1.0g NaOH+5g Na2CO3/250ml）
试剂D：在搅拌的同时，按以下顺序添加试剂：98 ml 试剂C + 1 ml 试剂A + 1 ml
标准牛血清白蛋白水溶液（0.1 mg/ml）
Bradford 蛋白测定乳清蛋白（-乳清蛋白），从之前的实验中纯化
碳酸氢铵水溶液，0.05 M
滤纸
标准牛血清白蛋白水溶液（0.1 mg/ml）
对先前实验纯化的乳白蛋白进行分光光度分析
碳酸氢铵水溶液，0.05 M
仪器设备
烧杯，100 毫升，250 毫升
试管或分光光度计样品池
微量移液器10~100l
分光光度计
涡旋混合器
步骤
Lowry 蛋白质测定用碳酸氢铵水溶液将10 mg 乳蛋白稀释至10 ml。如果乳蛋白已经是液体，则无需再次稀释。打开分光光度计电源，设置波长为540 nm，加热发动机15分钟以上。取6支试管，分别标记16，每支试管中加入5ml试剂D。按表将规定量（单位：ml）的水、BSA水溶液或未知溶液加入装有试剂D的试管中，立即摇匀，室温静置10分钟。试管数量
水
牛血清白蛋白溶液
未知解
静置10分钟后，向每个试管中加入0.25ml Folin-Ciocalteu试剂，并立即摇匀。然后让它在室温下静置30 分钟。使用分光光度计测定各样品在540 nm处的吸光度值（OD540）。将试管25中各BSA溶液的OD540值减去试管1的OD540值，即为BSA的OD540。通过将OD540 与BSA 浓度作图获得校准曲线。使用校准曲线计算试管7 至9 中溶液中的蛋白质浓度。 Bradford 蛋白质测定用碳酸氢铵水溶液将10 mg 乳蛋白稀释至10 ml。如果乳蛋白已经是液体，则无需再次稀释。打开分光光度计电源，设置波长为595 nm，加热发动机15分钟以上。取6支试管（或样品罐，视所用分光光度计型号而定），分别标记16，然后按表加入规定量（单位：微升）的去离子水、BSA水溶液或未知溶液准备样品。其中试管15用于测量测量线，试管6用于未知样品。试管数量
水
牛血清白蛋白溶液
未知解
向每个试管或样品罐中加入3.0ml Bradford染料试剂，翻转试管混合均匀，室温静置5分钟。使用分光光度计测定样品的OD595。如果未知样品的OD595大于试管5，则未知样品必须用水适当稀释后才能测量。 （注：Bradford试剂读数在5至60分钟内比较稳定，因此所有标准品和样品测量必须在这段时间内完成）每个BSA的OD595值减去试管1的OD595值即可得到正确的值试管2至5中的溶液。OD595。将OD595 与BSA 浓度作图，以获得穿过原点的校准线。使用校准曲线计算未知样品的蛋白质浓度。如果未知样品之前已被稀释，则必须将其转换为原始溶液或固体样品的蛋白质浓度。分光光度分析方法：用碳酸氢铵水溶液将10mg乳蛋白稀释至10ml。如果乳蛋白已经是液体，则无需再次稀释。打开分光光度计电源，将波长设置为260 nm，加热发动机15分钟以上。将约80%的碳酸氢铵水溶液和乳蛋白水溶液添加到两个光度计使用的石英罐中并备用。将装有碳酸氢铵水溶液的石英池放入分光光度计的样品池中。待吸收值稳定后，将仪器清零。将装有碳酸氢铵溶液的石英罐更换为装有乳蛋白溶液的石英罐，并测量乳蛋白吸收值D260。如果吸收值大于1.0，则测试前必须用碳酸氢铵水溶液稀释样品。将分光光度计的波长设置为280 nm，重复步骤4和5，测量乳蛋白的吸收值D280。使用原理中的公式计算蛋白质浓度。结果与讨论
测量蛋白质浓度时，为什么有些样品浓度“太高”，需要稀释？本实验中，乳蛋白为未知样品，以牛血清白蛋白为标准品，制作校准线，求出乳蛋白的浓度。这对测量结果有什么影响？如果样品中含有影响测量的干扰物质，应如何处理或校准才能获得正确的结果？本实验比较三种蛋白质分析方法的优缺点。除了本实验的三种方法之外，还有哪些方法可以测量蛋白质含量。
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用户评论
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